Mis13磷酸化促进减数分裂中动粒的组装

胡伟1,2，刘影1,2，孙力1,2，董国琛1,2，渡边嘉典1,2，马玲玲1,2，侯海彤1,2**

（1. 江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；
2. 江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122）

2.02.02.02.02.02.02.02.02.0Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122;江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122;江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122;江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122;江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122;江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122;江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122214122;;;;214122;;18317982029;;;;18262268165;;18317982029;;;;18262268165;;江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学;;;;江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学;;2359333089@qq.com;1402787497@qq.com;2359333089@qq.com;2359333089@qq.com;ywatanabe@jiangnan.edu.cn;2359333089@qq.com;2359333089@qq.com胡伟（1999），男，主要研究方向：染色体分离机制;;;;渡边嘉典，男，教授、博导，主要研究方向：染色体分离机制;;胡伟;刘影;孙力;董国琛;渡边嘉典;马玲玲;侯海彤HU Wei;LIU Ying;SUN Li;DONG Guochen;WATANABE Yoshinori;MA Lingling;HOU Haitong渡边嘉典 2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*LENORMAND T, ENGELSTäDTER J, JOHNSTON S E, et al. 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Nat Cell Biol, 2015, 17(4): 458-69.Mis13磷酸化促进减数分裂中动粒的组装|Mis13 Phosphorylation promotes meiotic assembly of kinetochores||1|胡伟|HU Wei|江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122|Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China|胡伟（1999），男，主要研究方向：染色体分离机制|江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学|214122|2359333089@qq.com|18317982029|18317982029<CR>|2|刘影|LIU Ying|江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122|Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China||||1402787497@qq.com||<CR>|3|孙力|SUN Li|江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122|Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China||||2359333089@qq.com||<CR>|4|董国琛|DONG Guochen|江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122|Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China||||2359333089@qq.com||<CR>*|5|渡边嘉典|WATANABE Yoshinori|江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122|Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China|渡边嘉典，男，教授、博导，主要研究方向：染色体分离机制|江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学|214122|ywatanabe@jiangnan.edu.cn|18262268165|18262268165<CR>|6|马玲玲|MA Lingling|江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122|Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China||||2359333089@qq.com||<CR>|7|侯海彤|HOU Haitong|江南大学未来食品科学中心，江苏省无锡市 214122；江南大学生物工程学院，江苏省无锡市 214122|Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China；School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China||||2359333089@qq.com||

摘要：动粒在进入减数分裂前期时发生解体，并在减数分裂I期之前重新组装。这一过程的调控机制及其对减数分裂的影响还不清楚。本研究发现，在裂殖酵母中Aurora B激酶介导动粒蛋白Mis13的磷酸化，从而调控减数分裂中动粒的组装。在减数分裂前期，随着动粒的解体， 细胞中观测不到Mis13-GFP荧光信号点；但在Mis13模拟磷酸化突变体中，能够观察到 Mis13-GFP荧光信号点，动粒蛋白Mis12和Nnf1在着丝粒上的定位明显增强。将细胞阻滞在减数分裂II的前期时，在Mis13模拟磷酸化突变体中，着丝粒上Mis13-GFP的荧光强度明显增强；在Mis13去磷酸化突变体中，Mis13-GFP的荧光强度明显降低。这些结果说明，Mis13磷酸化促进减数分裂中动粒的组装。

关键词：减数分裂；动粒；显微技术；动粒解体与组装；裂殖酵母

中图分类号：Q7

Mis13 Phosphorylation promotes meiotic assembly of kinetochores

HU Wei1,2, LIU Ying1,2, SUN Li1,2, DONG Guochen1,2, WATANABE Yoshinori1,2, MA Lingling1,2, HOU Haitong1,2

(1. Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China;
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China)

Abstract: Kinetochore disassembles during the prophase of meiosis and reassembles before meiosis I. The regulatory mechanism of this process and its impact on meiosis remain unclear. We find that Aurora B kinase mediates the phosphorylation of Mis13, thereby regulating the assembly of kinetochore during meiosis in fission yeast. During prophase of meiosis, Mis13-GFP foci largely disappear along with kinetochore disasseMis13 Phosphorylation promotes meiotic assembly of kinetochoresmbly; however, in the Mis13 phosphomimetic mutant, Mis13-GFP foci can be observed, and the centromeric localization of kinetochore proteins Mis12 and Nnf1 is significantly enhanced. When cells are arrested at the prophase of meiosis II, in the Mis13 phosphomimetic mutant, the intensity of Mis13-GFP foci is significantly enhanced; while in the Mis13 non-phosphorylatable mutant, the intensity of Mis13-GFP is significantly reduced. These results indicate that Mis13 phosphorylation promotes the kinetochore assembly during meiosis.

Key words: Meiosis; Kinetochore; Microscopy; Kinetochore disassembly and assembly; Schizosaccharomyces pombe

引言

有丝分裂和减数分裂是细胞分裂的两种基本方式：有丝分裂过程中DNA复制一次，细胞分裂一次，形成两个子细胞，染色体数目与亲本相同；减数分裂过程中，DNA复制一次，细胞会连续分裂两次，最终形成四个配子，染色体数目与亲本相比减半[1]。准确的染色体分离对于避免非整倍体和保持基因组稳定性至关重要[2, 3]。减数分裂过程中的染色体错误分离是导致人类非整倍体的主要原因，进而可能引发流产和唐氏综合征等疾病[4, 5]。

动粒是着丝粒上形成的一种特殊的结构，在纺锤体微管的附着中起着重要作用，对于染色体的精确分离至关重要。动粒主要包括三个部分：Knl1复合体、Mis12复合体和Ndc80复合体，统称为动粒KMN网络[6]。Mis12复合物包含四个亚基，裂殖酵母里为Mis13、Nnf1、Mis14和Mis12。有丝分裂细胞通过Aurora B激酶介导的Mis13磷酸化调控Mis12复合体与CENP-C的结合，从而调控动粒的组装[7]。

在脊椎动物中，CCAN蛋白在整个细胞周期中组成性定位于着丝粒[8, 9]。但动粒仅在有丝分裂期间定位在着丝粒上。在裂殖酵母和酿酒酵母细胞中，动粒在有丝分裂间期并不解体，整个有丝分裂细胞周期中动粒一直定位于着丝粒。但在减数分裂中，酵母细胞动粒会发生解体与重新组装。Aki Hayashi等人在裂殖酵母活细胞中观察了着丝粒蛋白以及动粒蛋白在整个减数分裂的行为[10]。发现，着丝粒蛋白（如CENPA）在整个减数分裂过程一直定位在着丝粒上。但对于动粒蛋白（如Mis12）在减数分裂开始时信号从着丝粒上消失，在进入减数分裂I期之前信号又会重新出现在着丝粒上。减数分裂过程中动粒解体与组装的调控机制是什么，动粒解体与组装的过程对减数分裂又会有什么影响。为了探究这一问题，本研究从动粒蛋白Mis13出发，通过荧光显微镜技术检测Mis13模拟磷酸化突变和Mis13去磷酸化突变对减数分裂中动粒组装的影响，来探究减数分裂中动粒组装的调控机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 耗材与试剂

2 × Rapid Taq Master Mix，2 × Phanta Max Master Mix （Dye Plus），2 × Phanta Flash Master Mix（Dye Plus），FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，FastPure Plasmid Mini Kit，ClonExpress II One Step Cloning Kit 均购于 vazyme 公司。遗传霉素，卡那霉素和潮霉素等抗生素均购于学校平台。DNA 提取液，PEG4000，LiAc，1XTE 等试剂均购于上海生工。噻苯咪唑（TBZ）购于上海源叶公司。实验所需的大肠杆菌E.coli XL-10-Gold，裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe），质粒pUC119均来源于本实验室。显微镜和荧光显微镜购于Nikon公司，PCR 仪购于Bio-RAD 公司，NANODROP ONE 和离心机购于赛默飞公司，紫外分光光度计购于MAPADA。引物合成和测序工作由安升达生物科技有限公司完成。

1.1.2 培养基与试剂

本研究主要使用四种培养基：培养大肠杆菌所用的 LB 培养基；培养酵母所用的完全培养基 YES 培养基；培养酵母所需的最小必须培养基EMM培养基；用于酵母产孢的培养基 SPA 培养基。上述培养基可根据需要加入抗性药物：遗传霉素50 μg·mL-1，卡那霉素50 μg·mL-1，潮霉素200 μg·mL-1，诺尔丝菌素100 μg·mL-1，杀稻瘟菌素50 μg·mL-1，金担子素A 1 μg·mL-1，氨苄西林100 μg·mL-1。

1.1.3 菌株列表

表1实验所用菌株列表

Tab.1 List of strains used in the experiment

菌株名称 基因型
Y16 h- Y17 h+ XH3 h- mis13-GFP::kanMX XH13 h- mis13-13myc::kanMX XH20 h- swi6△ XH36 h+ mis13-2E-13myc::kanMX XH40 h+ mis13-3E-13myc::kanMX XH59 h+ mis13-2A-13myc::kanMX XH49 h+ mis13-3A-13myc::kanMX XH116 h+ mis13-2E-GFP::natMX XH119 h+ mis13-3E-GFP::natMX XH122 h+ mis13-2A-GFP::natMX XH126 h+ mis13-3A-GFP::natMX XH621 h+ mis13-GFP::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mei4△::hphMX XH623 h- mis13-GFP::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mei4△::hphMX XH624 h+ mis13-2E-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mei4△::hphMX XH626 h- mis13-2E-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mei4△::hphMX XH653 h+ mis13-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX nnf1-GFP::hphMX mei4△::hphMX XH656 h-mis13-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX nnf1-GFP::hphMX mei4△::hphMX XH659 h+mis13-2E-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX nnf1-GFP::hphMX mei4△::hphMX XH661 h-mis13-2E-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX nnf1-GFP::hphMX mei4△::hphMX XH667 h+mis13-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mis12-GFP::LEU2 mei4△::hphMX XH668 h-mis13-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mis12-GFP::LEU2 mei4△::hphMX XH669 h-mis13-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mis12-GFP::LEU2 mei4△::hphMX XH670 h+mis13-13myc::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mis12-GFP::LEU2 mei4△::hphMX XH928 h- mis13-GFP::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX6 mes1△::LEU2 XH930 h+ mis13-GFP::kanMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX6 mes1△::LEU2 XH939 h- mis13-2E-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2 XH941 h+ mis13-2E-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2 XH945 h- mis13-3E-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2 XH948 h+ mis13-3E-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2 XH959 h- mis13-2A-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2 XH960 h+ mis13-2A-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2 XH965 h- mis13-3A-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2 XH969 h+ mis13-3A-GFP::natMX aur1R::pnda3-mCherry-atb2 sid4-mCherry::natMX mes1△::LEU2

1.2实验方法

1.2.1 质粒的构建

以基因组DNA为模板，设计引物扩增目的基因及其上下游各500 bp同源臂片段并用PCR纯化产物试剂盒回收，用One Step Cloning试剂盒（一步克隆法）将扩增的基因片段整合至质粒pUC119的多克隆位点区域（实验步骤见诺唯赞生物科技有限公司One Step Cloning试剂盒说明书）。以构建好的质粒为模板，设计突变引物进行全质粒PCR，然后在反应体系中加入Dpn Ⅰ酶以消化原模版质粒，并转化E.coli XL-10-Gold中进行质粒扩增，用试剂盒提取相应的质粒（实验步骤见南京诺唯赞生物技术股份有限公司的质粒提取试剂盒说明书），将质粒送到金唯智公司进行基因测序，选取正确突变的质粒。

1.2.2 醋酸锂转化法

将所需菌株从冰箱中取出，并划线接种于YES固体培养基上，培养一天后，从YES固体培养基上将菌株接种到液体YES培养基中（为了后续测量菌种浓度）培养。 接菌于培养液中，至指数生长期：测OD595大约0.5，离心去上清。用1 mL醋酸锂溶液洗涤细胞一次（改变细胞膜的通透性），离心去上清。重悬到100 μL的醋酸锂溶液中，依次加入5 μL鲑鱼精 DNA，2000 ng的转化片段，混匀，室温静置10 min。然后加入260 μL 40%PEG4000（用醋酸锂溶液配，现配现用），30℃培养1 h。加入43 μL二甲基亚砜溶液，轻柔混合，42℃热激5 min后，离心收菌。1 mL YES液体液体培养基洗涤，离心收菌，150 μL YES液体液体培养基重悬。涂布于YES固体培养基上。菌株在YES固体培养基上培养12-24小时后，复刻到含相应抗生素的YES固体培养基上，30℃培养3天。

1.2.3 裂殖酵母杂交

将包含所需基因型的不同交配型菌株分别接种于YES固体培养基，30℃培养16-24 h。用枪头挑取一定量的细胞，混合至SPA固体培养基上，加入10 μL的10 g·L-1亮氨酸溶液帮助其混合均匀，30℃培养16 h。将杂交细胞收集于2 mL的离心管中，加入 500 μL蜗牛酶裂解8 h。使用血细胞计数板对孢子进行计数，取一定量的孢子涂布于YES固体培养基上，30℃培养2天。复刻于含对应抗性的筛选平板上，一天后，对长出的菌落进行PCR，验证其基因型。

1.2.4 点接种实验

将菌株在YES液体培养基培养至对数中期（OD595=0.3~0.5）。菌株浓度稀释为2×10^6，2×10^5，2×10^4，2×10^3个/mL。分别取5 μL（即所取细胞个数分别为10^4个，10^3个，10^2个，10个）接入含不同浓度TBZ的YES固体培养基上，28℃培养3天。

1.2.5 动粒蛋白在减数分裂前期分布情况实验

将所需菌株活化于YES固体培养基中，28℃培养一天左右。菌株转接至EMM+5S固体培养基中，28℃培养16 h左右。将所需基因型的不同交配型菌株（h+与h-杂交），分别用枪头挑取一定量的细胞，混合至SPA固体培养基上。对于转录因子mei4+细胞中，28℃培养5 h左右。而对于转录因子mei4+缺失突变体中，在28℃培养12 h左右。之后在荧光显微镜下选用多通道拍照。在载玻片中央滴0.7 μL的清水，取少量细胞涂在清水中混匀，盖上盖玻片，按压盖玻片，使得细胞均匀的分布。采用60X倍镜，曝光强度设置为整体光强的1/16，保持曝光时间以及各荧光拍摄顺序固定：白光20 ms；绿色荧光300 ms；红色荧光200 ms，开启多通道拍摄，设置显微镜由上而下连续拍摄（拍摄范围：-4.2到2）17层，每层间隔4 μm，拍摄结束后，将17层照片利用Image J软件压缩（图片合成设置:起始层数 1至 终止层数 17）为一张照片，统计不同类别的细胞。

1.2.6 荧光强度测定实验

将所需菌株活化于YES固体培养基中，28℃培养一天左右。菌株转接至EMM+5S固体培养基中，28℃培养16 h左右。之后，菌株转接至EMM+5S固体培养基中，28℃培养16 h左右。将所需基因型的不同交配型菌株（h+与h-杂交），分别用枪头挑取一定量的细胞，混合至SPA固体培养基上，28℃培养16 h左右，在荧光显微镜下选用多通道拍照。在载玻片中央滴0.7 μL的清水，取少量细胞涂在清水中混匀，盖上盖玻片，按压盖玻片，使得细胞均匀的分布。采用60X倍镜，曝光强度设置为整体光强的1/16，保持曝光时间以及各荧光拍摄顺序固定：白光20 ms；绿色荧光300 ms；红色荧光200 ms，开启多通道拍摄，设置显微镜由上而下连续拍摄（拍摄范围：-4.2到2）17层，每层间隔4 μm。后续动粒蛋白的荧光强度测定使用Image J软件压缩（图片合成设置:起始层数 1至 终止层数 17）为一张照片。仅对细胞周期在减数分裂II期的前期细胞进行分析。对动粒蛋白的绿色荧光进行圈选，同时在其周围圈选相同的面积作为背景。因此动粒蛋白的有效荧光强度等于动粒蛋白的荧光强度减去动粒蛋白附近的荧光强度最后再乘以所选取的面积，并用GraphPad软件进行统计学分析得到最终的结果。

2结果

2.1探究动粒组装的分子机制

动粒组装机制在真核生物中高度保守[11, 12]。动物细胞中，动粒的组装依赖Mis12复合物，且由Aurora B激酶介导的Mis13的磷酸化调控这一过程[13, 14]。在裂殖酵母（S. pombe）中，Mis12复合物同样参与动粒组装[15]，其Mis13亚基的磷酸化可能具有类似功能，但具体机制仍需进一步验证。（对图片大小进行了调整，内容无任何修改）

图1 Mis13模拟磷酸化突变以及去磷酸化突变体的构建

（a）Mis13在人类，酿酒酵母和裂殖酵母中Aurora B激酶磷酸化位点对比（图片来自[16]）：红色部分为保守的Aurora B激酶磷酸化位点；（b）Mis13模拟磷酸化突变以及去磷酸化突变体中动粒蛋白Mis13-GFP的表达情况。

Fig.1 Construction of Mis13 phosphomimetic and non-phosphorylatable mutations.

Comparison of Aurora B kinase phosphorylation sites of Mis13 in humans, S.cerevisiae and S.pombe: The red parts represent the conserved Aurora B kinase phosphorylation sites; (b) The expression of the kinetochore protein Mis13-GFP in Mis13 phosphomimetic and non-phosphorylatable mutations.

对比人类与酿酒酵母中Aurora B激酶磷酸化位点，在裂殖酵母中Mis13蛋白上的Aurora B激酶磷酸化位点可能在S68和S77[16]。邻近的S67残基位于两个精氨酸（R）之后，构成Aurora B激酶底物的标志序列，在体内很可能也被磷酸化修饰。因此本实验不仅在Ser68，Ser77位点构建突变体，另外还同时在Ser67位点上构建相关突变体。将Mis13蛋白上的Aurora B激酶磷酸化位点S68，S77突变为丙氨酸（A），构建去磷酸化突变（2A），以及将S67，S68，S77位点突变为丙氨酸（A），构建去磷酸化突变（3A）。

谷氨酸属于酸性氨基酸，带有负电荷，可以模拟磷酸化修饰。将Mis13蛋白上的Aurora B磷酸化位点S68，S77突变为谷氨酸（E），构建模拟磷酸化突变（2E）。此外将S67，S68，S77位点突变为谷氨酸（E），构建模拟磷酸化突变（3E）。

引入GFP荧光标签，标记有丝分裂中的动粒蛋白Mis13。在Mis13磷酸化突变（mis13-2E和mis13-3E）以及去磷酸化突变（mis13-2A和mis13-3A）中，都能观察动粒蛋白Mis13-GFP的荧光信号点（图1b）。说明在裂殖酵母中，Mis13模拟磷酸化突变以及去磷酸化突变体中Mis13-GFP融合蛋白能够正常表达，因此我们可以进行下一步的研究。

2.2 Mis13模拟磷酸化突变以及去磷酸化突变对有丝分裂的影响

噻苯达唑（TBZ）是苯并咪唑类化合物的衍生物，此药物会抑制微管蛋白的聚合反应，从而干扰染色体分离的过程[17]。本实验通过将mis13-2E突变体，mis13-3E突变体，mis13-2A突变体,mis13-3A突变体在TBZ药物作用下的生长情况与野生型进行对比，来验证Mis13磷酸化突变（mis13-2E和mis13-3E）以及去磷酸化突变（mis13-2A和mis13-3A）对有丝分裂的影响。

图2 Mis13模拟磷酸化突变以及去磷酸化突变对TBZ敏感度测试

Fig.2 TBZ sensitivity testing for mis13 phosphomimetic and non-phosphorylatable mutants.

Swi6是异染色质蛋白 HP1（Heterochromatin Protein 1）的同源物，主要参与异染色质的形成和维持，在裂殖酵母中向异染色质区域募集黏连蛋白[18, 19]。敲除swi6+基因会导致异染色质结构破坏，从而影响姐妹染色体间的黏连，增加姐妹染色体错误分离的概率，使细胞对微管抑制剂TBZ 敏感[20]。对照菌株swi6△ 在TBZ浓度为12 μg/mL和15 μg/mL的条件下，其生长受到了抑制。mis13-2E突变体和mis13-3E突变体在TBZ药物作用下的生长情况与野生型相同，说明Mis13模拟磷酸化突变对有丝分裂没有影响。但是发现mis13-2A突变体和mis13-3A突变体在TBZ药物作用下的生长情况与野生型相比，其生长也受到了抑制，说明Mis13去磷酸化突变对有丝分裂有影响。表明Aurora B激酶磷酸化动粒蛋白Mis13有助于染色体的精确分离。

2.3 AuroraB 激酶介导的Mis13磷酸化影响减数分裂动粒的组装

为了探究Mis13磷酸化突变以及去磷酸化突变对减数分裂的影响，本研究引入GFP荧光标签，标记减数分裂中的动粒蛋白Mis13。引入mCherry红色荧光蛋白标签，标记微管蛋白Atb2和纺锤体极体蛋白Sid4。在减数分裂前期，来自亲本的两个纺锤体极体会融合成一个纺锤体极体[21]。因此，减数分裂前期，在显微镜下由mCherry红色荧光蛋白标记的纺锤体极体仅呈现为一个红点。此时纺锤体极体通过聚集在附近的着丝粒牵引染色体在细胞内大幅震荡，而为这一运动提供动力的微管（mCherry标记）则呈现为一条从纺锤体极体出发的长线。（对图片大小进行了调整，内容无任何修改）

图3 Mis13模拟磷酸化以及去磷酸化突变中动粒蛋白Mis13在减数分裂前期的分布情况

（a）动粒蛋白Mis13在减数分裂前期的分布情况;（b）减数分裂前期Mis13-GFP信号点的计数。采用卡方检测对统计结果进行统计学分析。*：0.01<p<0.05，有差异性。**：0.001<p<0.01，差异性较显著。****：p<0.0001，差异性显著。

Fig.3 The distribution of kinetochore protein Mis13 during meiotic prophase in Mis13 phosphomimetic and non-phosphorylatable mutations.(a) Distribution pattern of Mis13 protein during meiotic prophase; (b) In the case of Mis13-GFP signal points during meiotic prophase. Statistical analysis of the results was conducted by Chi-square test. *: 0.01<p<0.05, significant. **: 0.001<p<0.01, highly significant. ****: p < 0.0001, extremely significant.

处于减数分裂前期的野生型细胞中，在减数分裂前期大部分细胞（>70%）未能观察到动粒蛋白Mis13-GFP荧光信号点，表明动粒Mis12复合物在进入减数分裂时会发生解体。在mis13-2A突变体和mis13-3A突变体中，绝大多数细胞（>90%）同样观察不到动粒蛋白Mis13-GFP荧光信号点（如图3b）。这说明Mis13去磷酸化突变不会影响减数分裂前期Mis12复合物的解体。但在mis13-2E突变体和mis13-3E突变体中,都能够观察到动粒蛋白Mis13-GFP荧光信号点。说明Mis13的模拟磷酸化突变导致了动粒在减数分裂前期未解体。表明在减数分裂中，动粒组装受Aurora B磷酸激酶介导的Mis13磷酸化调控。

为了更直观的观察动粒蛋白在减数分裂中的分布情况，本实验引入转录因子mei4+缺失突变，将细胞停滞在减数分裂前期[22]。

图4 mei4△突变体下野生型以及Mis13模拟磷酸化突变体中Mis12复合物在减数分裂前期中的分布情况

（a）mei4△突变体下野生型以及Mis13模拟磷酸化突变体中Mis13蛋白在减数分裂前期的分布情况；（b）mei4△突变体下野生型以及Mis13模拟磷酸化突变体中Mis12蛋白在减数分裂前期的分布情况；（c）mei4△突变体下野生型以及Mis13模拟磷酸化突变体中Nnf1蛋白在减数分裂前期的分布情况；（d）mei4△突变体下野生型以及Mis13模拟磷酸化突变体中在减数分裂前期不同动粒蛋白信号点的情况。采用卡方检测对统计结果进行统计学分析。*： p<0.05，有差异性。***：0.0001<p<0.001，差异性较显著。****：p<0.0001，差异性显著。

Fig. 4 Distribution of the Mis12 complex during meiotic prophase in wild-type and Mis13 phosphomimetic mutation under mei4△ mutant background. (a) The distribution of Mis13 protein during meiotic prophase in wild-type and Mis13 phosphomimetic mutation under mei4△ mutant background; (b) The distribution of Mis12 protein during meiotic prophase in wild-type and Mis13 phosphomimetic mutation under mei4△ mutant background; (c) The distribution of Nnf1 protein during meiotic prophase in wild-type and Mis13 phosphomimetic mutation under mei4△ mutant background; (d) In the case of kinetochore proteins signal points during meiotic prophase in wild-type and Mis13 phosphomimetic mutation under mei4△ mutant background. Statistical analysis of the results was conducted by Chi-square test. *: 0.01<p<0.05, significant. ***: 0.0001<p<0.001, highly significant. ****: p < 0.0001, extremely significant.

mei4△突变体中，动粒Mis13蛋白，Mis12蛋白和Nnf1蛋白大多数细胞能够观察到绿色荧光信号点，此时大多数细胞的动粒已经开始组装了。在mis13-2E突变体中，动粒Mis13蛋白，Mis12蛋白和Nnf1蛋白也都能观察到绿色荧光信号点（图4d）。在这个实验中，我们还发现与野生型相比，动粒Mis13蛋白，Mis12蛋白和Nnf1蛋白在mis13-2E突变体中绿色荧光的信号明显增强了，说明在mis13-2E突变体中Mis12复合物的定位增强了。进一步证明了Mis13模拟磷酸化突变会导致动粒不解体。

图5 mes1△突变体下Mis13模拟磷酸化以及去磷酸化突变中动粒蛋白Mis13在减数分裂中的定位情况

（a）mes1△突变体下Mis13蛋白在减数分裂中的分布情况：（b）mes1△突变体下Mis13模拟磷酸化以及去磷酸化突变中动粒蛋白Mis13在减数分裂中的荧光强度。采用单因素方差分析对统计结果进行统计学分析。****：p<0.0001，差异性显著。

Fig. 5 The localization of the kinetochore protein Mis13 during meiosis in Mis13 phosphomimetic and non-phosphorylatable mutations under mes1△ mutant background. (a) Distribution of Mis13 protein during meiosis under mes1△ mutant background; (b) Fluorescence intensity of kinetochore protein Mis13 during meiosis in Mis13 phosphomimetic and non-phosphorylatable mutations under mes1△ mutant background. Statistical analysis of the results was conducted by One-way ANOVA. ****: p < 0.0001, significant.

为了定量研究Mis13磷酸会对动粒组装的影响，我们引入mes1△突变体，将细胞同步化在减数分裂II期开始之前[23]。此时，纺锤体极体分布在细胞两极，中间没有微管连接，在显微镜下能够观察到两个红点（图5a）。动粒蛋白Mis13-GFP的荧光信号点的个数统一以及定位也相同，在这个时期能够更精确的测量出动粒蛋白的荧光强度。结果显示（图5b），与野生型相比，在Mis13模拟磷酸化突变体中（mis13-2E和mis13-3E），动粒蛋白Mis13-GFP的荧光点强度明显增强。说明在Mis13模拟磷酸化突变体在动粒上的定位增加。在Mis13去磷酸化突变体中（mis13-2A和mis13-3A），动粒蛋白Mis13-GFP的荧光强度明显降低，说明此时动粒定位减少。这些结果进一步证明了减数分裂过程中，动粒组装受Aurora B磷酸激酶介导的Mis13磷酸化调控。

3讨论

本研究发现了减数分裂中动粒解体与组装的调控机制：在减数分裂中，Aurora B激酶介导的Mis13磷酸化促进动粒的组装。动粒解体的可能与蛋白质磷酸酶PP1有关，但具体机制还尚未发现。

此外，动粒解体与组装的过程对减数分裂具体有什么影响，需要进一步分析。未来可以通过动粒蛋白Mis13模拟磷酸化突变和Mis13去磷酸化突变，去调控动粒解体与组装的过程，观察减数分裂过程是否受到影响，从而探究动粒解体与组装的过程对减数分裂的重要性。

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作者简介：胡伟（1999），男，主要研究方向：染色体分离机制

通信联系人：渡边嘉典，男，教授、博导，主要研究方向：染色体分离机制. E-mail: ywatanabe@jiangnan.edu.cn